100次浏览 发布时间：2024-11-05 16:17:34
前言
RT-PCR就是逆转录PCR（Reverse transcription PCR）或称为反转录PCR（Reverse transcription-PCR，RT-PCR），是以RNA为材料应用于PCR扩增中的一种实验方法。首先通过逆转录酶将总RNA或信使RNA（mRNA）转录成互补DNA（cDNA）。其次Taq DNA聚合酶以cDNA为模板进行qPCR扩增。RT-PCR已被广泛应用于多种分子生物学应用中，包括基因表达分析、基因测试、RNA干扰验证检测、微阵列验证、病原体检测和疾病研究。
RT-PCR的方法之一步法和两步法
RT-PCR其操作方法分为两种，即一步法和两步法。一步法RT-PCR，逆转录同PCR扩增结合在一起，即cDNA合成与PCR扩增反应在同一管Buffer及酶中进行，一步完成。两步法RT-PCR，RNA首先在反转录酶的作用下生成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，分成两步进行。
两种方法如何选择及优缺点对比
RT-PCR中模板的选择
在RT-PCR 实验中，选择总RNA或纯化的mRNA作为模板进行逆转录十分重要。mRNA虽然能提供略高的灵敏度，但总RNA经常使用，具有较mRNA更重要的优势。第一，其过程需要较少的纯化流程，这保证了更好的回收模板和更好的把结果标准化为起始的细胞数。第二，避免mRNA富集步骤，为了避免不同mRNA的回收率而带来结果偏移的可能性。总之，在大多数的应用中，目标基因的相对定量比检测的绝对灵敏度更重要，因此在多数情况下，总RNA更适用。
反转录酶的选择
反转录酶（Reverse transcriptase）又称逆转录酶。是以RNA为模板指导dNTP合成互补DNA（cDNA）的酶。一部分反转录酶具有RNA酶活性，能够在转录后降解RNA-DNA杂交链中的RNA链。如果反转录酶没有Rnase酶活性，可加入RNaseH来获得更高的qPCR效率。常用的酶包括Money鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶和禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶。依据RT-PCR，理想的状态下是选择具有较高热稳定性的反转录酶，cDNA的合成才能在较高的温度下进行，确保成功转录具有较高二级结构的RNA，并确保在整个反应过程中的全部活性，从而得到质量更高的cDNA。
RT-PCR引物的选择
逆转录引物一般包含3种：oligo dT引物，随机引物和特异性引物。对于短的且不具备发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可用。
RT-PCR引物设计原则
1. 上下游引物要保守：扩增子长度需选择一段保守片段（100-200 bp）进行PCR扩增，选择片段需跨越内含子，因内含子的基因组DNA序列不会被扩增，也可减少从污染的基因组DNA中扩增得到的假阳性风险。引物选取同样需要保守。
2. 引物长度和Tm值：引物设计长度为18-25 bp，Tm值在50-65℃之间，引物中GC含量在40-60%。设计引物时尽量避免出现4个或超过4个G碱基。
RT-PCR实验阴性对照
反转录阴性对照应包括在所有的RT-PCR的实验中，用来检测DNA是否污染（如基因组DNA或PCR产物）。该对照所指不加反转录酶，通过反转录过程得到cDNA在进行荧光定量PCR检测。如检测到扩增，则样本中可能含有基因组DNA污染。